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實驗室植物核酸的提取

發布時間:2016-12-16 09:30:17
DNA提取 

樣品收集:取新鮮植物葉片(大約250mg)于凍存管中,向管中加入1大4小的鋼珠,液氮中冷凍5分鐘,之后取出劇烈振搖,待樣品被研細后用磁鐵將鋼珠吸出,樣品凍存于-80℃,鋼珠用無水乙醇洗滌后用于下一次樣品收集。 
 溶液配制: 
溶液 A :100mM Tris 
           100nM NaCl            10mM EDTA 
           1% 十二烷基肌氨酸鈉            0.1% NaSO3 
           2%聚乙烯吡咯烷酮 
調節PH至8.5 
溶液B;酚 - 氯仿 - 異戊醇(25:24:1) 溶液C:硅膠基質 
溶液D:3M NaAc(pH4.8) 
溶液E:異丙醇 溶液F:70%的乙醇 
溶液G:含有40ug/ml的TE緩沖液 
        TE緩沖液(10 mMTris, 1 mM EDTA, [pH 8])  步驟: 
1、取出液氮中凍存的樣品于2ml離心管中,加入700ul的溶液A,渦旋振蕩1分鐘 
2、加入700ul 溶液B,800轉/分振蕩器震蕩10分鐘。 3、加入500ul溶液C,混勻后3200g離心10分鐘。 
4、上層相液體移入1.5ml離心管,加入60ul溶液D和600ul溶液E,渦旋振蕩2分鐘。 5、3200g離心2分鐘。 
6、上清倒出,用500ul溶液F洗滌DNA。 7、離心棄洗液后,干燥DNA。 
8、加入60ul溶液G后于4℃過夜溶解DNA。 

RNA提取 

準備工作(試劑配置和器材準備) 
實驗所用的研臼,杵,小藥勺,試劑瓶,量筒,剪刀等與實驗材料有接觸的器皿都要在0.1%的DEPC水中浸泡24h,用錫紙包裹于180℃(烘箱)高溫滅菌2h或160℃高溫滅菌4h后備用;塑料制品如進口tip頭、eppendorf管(1.5ml,0.5ml)高壓滅菌,烘干后備用(放置時間不宜超過一周)。RNase-free water的制備如下:在蒸餾水中加入0.1%體積的DEPC原液(如1000ml蒸餾水中加1mlDEPC原液), 用塑料膜封口后,充分混勻,靜置過夜,高壓滅菌.(注意:DEPC有強誘癌作用,操作時須謹慎,加了DEPC的水放通風櫥中,避免吸入氣體)  
三、實驗操作步驟 
1)稱取0.5g植物材料,用液氮速凍后,迅速研磨成細粉,分裝于兩個1.5ml的eppendorf離心管中 
注意:動作盡量迅速,避免RNA降解;另外,要盡量地選用幼嫩的植物材料,因其RNA的含量相對于老材料要豐富。 2)加入1ml TRIzol,用力搖動使混合均勻,室溫下放置5min(混合液呈棕紅色,可分成三大層:上層水相中含有RNA,中層含蛋白和下層有機相為材料殘渣及DNA等) 
注意:樣品的量不要超過TRIzol體積的10%,過多反而會降低RNA的得率。 
3)(此步可根據實際情況選擇做還是不做)當樣品中蛋白、脂肪及多糖含量較高時,離心(4℃,12,000g,10min), 小心將上清液吸入1.5ml的eppendorf離心管中 
注意:RNA的抽提過程中的所有離心操作皆在4℃的冷凍離心機上進行(下同) 
4)每管加0.2ml氯仿,用力振蕩15sec,室溫放置2-3min,離心(4℃, 12,000g,15min) 
5)將上清液(約600ul)吸入1.5ml的新eppendorf離心管中,加等體積異丙醇,顛倒混勻(動作要緩和),-20℃冰箱中放置30min(過夜則沉淀更加充分)
 6)離心(4℃,12,000g,15min) 
7)棄上清,收集RNA沉淀,加1ml 75%乙醇洗滌沉淀1-2次(離心4℃,12000g,10-15min,棄上清,收集RNA沉淀) 注意:75%乙醇為無水乙醇和DEPC處理過的蒸餾水所配制
 8)沉淀室溫下干燥15-20min 
注意:不應該完全干燥失水,否則RNA沉淀很難溶解
 9)溶于適量(30-50ul)RNase-free water中 
10)(此步可根據實際情況選擇做還是不做)若該種植物含有較多多糖,則需在60℃水浴中溫浴5min, 離心(4℃,12,000g,10min)吸取上清備用,此即為所需的RNA液 
11)儲存在-70℃的超低溫冰箱中備用

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